Το Whole Exome Sequencing (WES) είναι μια σύγχρονη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που βασίζεται στην τεχνολογία της Αλληλούχηση Επόμενης Γενιάς (Next Generation Sequencing – NGS). Πρόκειται για αλληλούχηση των εξονίων των περίπου 20.000 γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, δηλαδή περίπου το 1-2% του ανθρώπινου γονιδιώματος. Σε αυτές τις περιοχές ταυτοποιείται το 85% των παθογόνων γενετικών παραλλαγών που προκαλούν σπάνια γενετικά νοσήματα.
Ο γονιδιακός αυτός έλεγχος έχει ως στόχο την ταυτοποίηση της μοριακής βλάβης, η οποία μπορεί να δικαιολογήσει τον υπό εξέταση φαινότυπο του ασθενούς. Η συγκεκριμένη γενετική εξέταση συνιστάται σε περιπτώσεις σπάνιων και πολύπλοκων κλινικών εικόνων και σε γενετικά σύνδρομα με μεγάλη κλινική ετερογένεια.
Θετικά αποτελέσματα: Αναφέρονται οι παθογόνες και οι πιθανώς παθογόνες παραλλαγές, που ανιχνεύονται σε γονίδια που με τα σημερινά δεδομένα σχετίζονται ή πιθανώς σχετίζονται με το φαινότυπο του ασθενούς.
Αβέβαιης κλινικής σημασίας (Variant of Uncertain Significance - VUS): Αναφέρονται παραλλαγές που μπορεί να ευθύνονται για το νόσημα που ελέγχεται, αλλά δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία ώστε να χαρακτηριστούν πιθανώς παθογόνες ή πιθανώς ήπιες. Επιπρόσθετος κλινικός έλεγχος ή/και γενετικός έλεγχος άλλων μελών της οικογένειας μπορεί να ζητηθεί προκειμένου να καθοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια ο ρόλος της παραλλαγής.
Αρνητικά αποτελέσματα: δεν αναφέρονται παραλλαγές. Αυτό σημαίνει ότι όταν έγινε ο έλεγχος, δεν ταυτοποίηθηκαν παραλλαγές που να μπορούν να εξηγήσουν το λόγο παραπομπής. Ωστόσο, αυτό δε σημαίνει ότι δεν υπάρχει γενετικό νόσημα που να το προκαλεί ή ότι γενικά δεν υπάρχουν παθογόνες παραλλαγές. Είναι πιθανό ο έλεγχος να μη βρήκε την αιτιοπαθογόνο παραλλαγή λόγο τεχνικών περιορισμών όπως περιγράφονται παρακάτω ή/και το υποκείμενο γενετικό νόσημα να μην έχει αναγνωριστεί ακόμα.
Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχει η πιθανότητα μη ανίχνευσης αιτιοπαθογόνων παραλλαγών σε ποσοστό που διαφοροποιείται κατά περίπτωση. Με τις υπάρχουσες τεχνολογίες και την παρούσα γνώση για το ανθρώπινο γονιδίωμα το ποσοστό απόδοσης δεν ξεπερνά το 30%-40%.
Τα ευρήματα αυτά μπορεί να αφορούν παραλλαγές σε γονίδια που είναι υπεύθυνα για την εμφάνιση νόσου με υπολειπόμενο χαρακτήρα κληρονόμησης (φορεία), παραλλαγές σε γονίδια που σχετίζονται με νοσήματα όψιμης εμφάνισης, παραλλαγές σε γονίδια που προσδίδουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης κακοήθειας κλπ.
Η πιθανή αναφορά τυχαίων ευρημάτων βασίζεται: α) στην τυχαία εύρεσή τους κατά τη διαδικασία διερεύνησης της αιτίας παραπομπής, β) στη σαφή κατηγοριοποίησή τους ως παθογόνων ή πιθανώς παθογόνων σύμφωνα με τα σημερινά βιβλιογραφικά δεδομένα και τις καταχωρίσεις σε έγκριτες βάσεις δεδομένων (π.χ. ClinVar), γ) στη δυνατότητα περαιτέρω μελέτης και κλινικής αξιοποίησής τους από εξειδικευμένους φορείς.
Επιπλέον, η πιθανή αναφορά κάποιων τέτοιων ευρημάτων δεν υποδεικνύει τον πλήρη έλεγχο για αυτά και δεν μπορεί να αποκλείσει την ύπαρξη άλλων. Η μη αναφορά τυχαίων ευρημάτων δεν αποκλείει την ύπαρξή τους και δεν εξασφαλίζει τον ενδελεχή, πλήρη και συστηματικό έλεγχο για αυτά.
Για την αλληλούχηση WES κατασκευάζεται «βιβλιοθήκη» με εμπλουτισμό μέσω ανιχνευτών σχεδιασμένων για τις εξονικές αλληλουχίες του γονιδιώματος (IDT xGen Exome Research v2 της εταιρείας Integrated DNA Technologies) που καλύπτουν περίπου 34Mb. Οι αλληλουχίες αυτές αντιστοιχούν σε διατηρημένες κωδικοποιούσες περιοχές περίπου 19.000 γονιδίων (Whole Exome Sequencing). Η διαδικασία της αλληλούχησης πραγματοποιείται στο εργαστήριο NIPD Genetics(Λευκωσία, Κύπρος) σε σύστημα Illumina NextSeq-500.
Η βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιείται από την εταιρεία βιοπληροφορικής Saphetor με χρήση ειδικού αλγοριθμικού συστήματος στην πλατφόρμα VarSome Clinical για τη στοίχιση των αναγνώσεων που παρήχθησαν κατά την αλληλούχηση με το γονιδίωμα αναφοράς GRCh37/hg19, και για την ανίχνευση των παραλλαγών σε σύγκριση με το γονιδίωμα αναφοράς GRCh37/hg19. Το φιλτράρισμα αξιολόγηση και ερμηνεία των παραλλαγών πραγματοποιείται Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του ΕΚΠΑ από εξειδικευμένο προσωπικό με χρήση της πλατφόρμας VarSome Clinical και της εφαρμογής VarAFT 2.16 (http://varaft.eu) (Desvignes et al., 2018) ακολουθώντας τη στρατηγική καθοδηγούμενη από το φαινότυπο (Marinakis et al., 2021).
Η συγκεκριμένη ανάλυση περιλαμβάνει αξιολόγηση των παραλλαγών με βάση την κατηγορία της παραλλαγής, τη συχνότητα εμφάνισης στον πληθυσμό, την πρόβλεψη παθογονικότητας και τη σύνδεση με τον φαινότυπο, χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων γενετικής: 1000 Genome, gnomAD Ε (ExAC), UMD-Predictor, Shift, PolyPhen, Mutation Taster, Mutation Assessor, ClinVar, VarSome, ΟΜΙΜ, HPO (Human Phenotype Ontology) κ.α..
Με την παρούσα τεχνική δεν γίνεται πλήρης κάλυψη ολόκληρου του γονιδιώματος, αλλά αλληλούχηση στο σύνολο των εξονικών περιοχών των γονιδίων (~19.000) του ανθρώπινου γονιδιώματος, ως εκ τούτου δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ύπαρξης άλλων παραλλαγών σε άλλη θέση στο γονιδίωμα που να σχετίζονται με το συγκεκριμένο φαινότυπο.
Η ανάλυση αφορά συγκεκριμένο τύπο μοριακών βλαβών στο DNA, όπως σημειακές παραλλαγές ενός νουκλεοτιδίου ή μερικών νουκλεοτιδίων. Ως εκ τούτου δεν μπορούν να αποκλεισθούν άλλοι τύποι παραλλαγών, όπως ελλείψεις γονιδίων, διπλασιασμοί πολλών γονιδιακών θέσεων ή επεκτάσεις επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών για τις οποίες απαιτείται διαφορετικού τύπου εργαστηριακή προσέγγιση.
Η μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε δεν επιτρέπει την διερεύνηση και τον αποκλεισμό παραλλαγών σε μη κωδικοποιούσες περιοχές ή σπάνιων γενετικών φαινομένων όπως ο μωσαϊκισμός και η γονιδιακή μετατροπή.
Η ανάλυση μπορεί να αποκαλύψει την ύπαρξη ευρημάτων Αβέβαιης Κλινικής Σημασίας (Variant ofUncertain Significance - VUS), τα οποία βάση της υπάρχουσας γνώσης δεν μπορούν να τεκμηριώσουν την εμφάνιση της πάθησης με βεβαιότητα.
Οι μεθοδολογίες αλληλούχησης νέας γενιάς δύναται να αποδίδουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα της τάξεως του 5-10%.
Η ανάλυση των παραπάνω γονιδίων μπορεί να αποδώσει ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα της τάξεως του 3-8%.
Οι επιλογές των γονιδίων που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη βιοπληροφορική ανάλυση ανανεώνονται τακτικά εξαιτίας της συνεχούς ταυτοποίησης νέων γονιδίων/δεδομένων.
Τα αποτελέσματα δεν είναι βέβαιο ότι θα οδηγήσουν στην αποκάλυψη θεραπείας ή την πρόγνωση της πάθησης.
Συνιστάται ισχυρά οι ασθενείς να δέχονται γενετική συμβουλευτική τόσο πριν τη διενέργεια της εξέτασης, ώστε να ενημερώνονται για τα πιθανά αποτελέσματα και τους περιορισμούς, όσο και μετά για την επεξήγηση των πιθανών αποτελεσμάτων ή/και των επόμενων βημάτων.
Για την εξέταση χρειάζεται δείγμα ολικού αίματος σε αντιπηκτικό EDTA τουλάχιστον 2ml.
Το έντυπο παραπομπής και το έντυπο συγκατάθεσης είναι απαραίτητα συνοδευτικά του δείγματος (Βλέπε οδηγίες παραπομπής)
Για οποιαδήποτε πληροφορία σχετικά με τις παραπάνω αναλύσεις, αλλά και την παραπομπή περιστατικού απευθυνθείτε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής τηλεφωνικά (213-2013470) ή ηλεκτρονικά (iatriki-genetiki@med.uoa.gr).
Η παραπομπή περιστατικού γίνεται αποκλειστικά από τον θεράποντα ιατρό ή κατόπιν ραντεβού με κλινικό του εργαστηρίου.
Η απάντηση δίνεται έπειτα από ολοκληρωμένη συζήτηση με τον παραπέμποντα ιατρό.
