Μοριακός Καρυότυπος ή Μικροσυστοιχίες συγκριτικού γενομικού υβριδισμού (array CGH)
Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες ευθύνονται για ένα ευρύ φάσμα σύνθετων φαινοτύπων, συμπεριλαμβανομένης της νοητικής υστέρησης και των συγγενών ανωμαλιών, και εντοπίζονται σε περίπου 1 ανά 200 νεογέννητα. Για περισσότερο από 30 χρόνια, η μικροσκοπική χρωμοσωμική ανάλυση (καρυότυπος) θεωρείται ο χρυσός κανόνας για τη διάγνωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε ασθενείς με διαφόρου βαθμού νοητική ή αναπτυξιακή υστέρηση (ΝΥ, ΑΥ) και / ή χωρίς πολλαπλές συγγενείς ανωμαλίες (ΠΣΑ). Η κλασική όμως αυτή κυτταρογενετική ανάλυση δεν είναι σε θέση να εντοπίσει αξιόπιστα ανακατατάξεις γενομικών τμημάτων μικρότερων των 5 εώς 10 μεγαβάσεων (Mb). Επιπροσθέτως, η μικροσκοπική εξέταση των χρωμοσωμάτων, μπορεί να μην αποκαλύπτει την χρωμοσωμική προέλευση των υπεράριθμων χρωμοσωμάτων-δεικτών (markers), ούτε να εξακριβώνει τις μικρές ανακατατάξεις, ιδιαίτερα στις υποτελομεριδιακές περιοχές των χρωμοσωμάτων και επιπλέον δεν έχει την δυνατότητα ακριβούς εντοπισμού της θέσης θραύσης των χρωμοσωμικών αναδιατάξεων. Μεγαλύτερη ανάλυση των χρωμοσωμάτων με άλλες ειδικές μεθόδους (high resolution karyotype) μπορεί να επιτρέψει τη διάγνωση μικρότερων ανωμαλιών (έως 5 Mb), αλλά αυτή η εργαστηριακή διαδικασία δεν χρησιμοποιείται στην καθημερινή πρακτική λόγω του αυξημένου κόστους αλλά κυρίως του πρόσθετου φόρτου εργασίας.
Η εισαγωγή των μικροσυστοιχειών συγκριτικού γενομικού υβριδισμού (array CGH) στην κλινική πρακτική στοχεύει στην εμφανή αναγκαιότητα να βελτιωθεί το ποσοστό της διάγνωσης γενετικών ανωμαλιών που οδηγούν σε φυσική και λειτουργική ανωμαλία. Για παράδειγμα, στις σοβαρές (μείζονες) ανωμαλίες, που υπάρχουν σε ~2-3% των νεογέννητων και είναι η κύρια αιτία βρεφικής θνησιμότητας ή/ και απώτερης νοσηρότητας, χρωμοσωμικές ανωμαλίες αποκαλύπτονται μόνο στο 0.5% με τον κλασικό καρυότυπο. Από τα δε άτομα με ιδιοπαθή μεμονωμένη νοητική υστέρηση, περισσότερα από 75% παραμένουν ακαθόριστης αιτίας μετά τον καθιερωμένο γενετικό έλεγχο. Έτσι, μετά τη κλινική εκτίμηση και το γενετικό έλεγχο η υποκείμενη αιτιολογία παραμένει ανεξήγητη για τα περισσότερα παιδιά με λειτουργικές και φυσικές αναπηρίες. Συνολικά πάνω από 25% των ασθενών με δυσμορφολογίες και ΝΥ παραμένουν αδιάγνωστοι (Flint και Knight, 2003).
Το κύριο πλεονέκτημα των a-CGH είναι η ικανότητα να ανιχνεύουν οποιαδήποτε ποσοτική αλλαγή στο DNA, όπως ανευπλοειδίες, ελλείμματα και διπλασιασμούς, με αναλυτική ευχέρεια κατά πολύ ισχυρότερη (10-10000 φορές) από τον κλασικό καρυότυπο, ανάλογα με το μέγεθος του στόχου και την κάλυψη και τη πυκνότητα των ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται.
Εμπειρία του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής
Το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής διαθέτει από το 2008 το σύστημα της εταιρείας Agilent, μίας εκ των 4 διεθνώς αναγνωρισμένων εταιρειών παραγωγής μικροσυστοιχιών. Οι Agilent DNA συστοιχίες είναι μικροσυστοιχίες συγκριτικού γενομικού υβριδισμού με απόσταση παρακείμενων ανιχνευτών από 43Κb για τις λιγότερο υψηλής ευκρίνειας έως 2.1Κb για τις υψηλής ευκρίνειας μικροσυστοιχίες. Παρέχουν κάλυψη των κωδικοποιουσών (~7.4Kb απόσταση παρακείμενων ανιχνευτών) και μη κωδικοποιουσών περιοχών του γονιδιώματος (16.5Kb απόσταση παρακείμενων ανιχνευτών) [gene oriented arrangement]. Οι υψηλής ευκρίνειας μικροσυστοιχίες έχουν την δυνατότητα κάλυψης του ~99% των γονιδίων ?3 ανιχνευτές. Οι συστοιχίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υψηλής ευκρίνειας 1Χ244 (>236,000 ανιχνευτές; Απόσταση μεταξύ των ανιχνευτών 8.9Kb) αλλά κατά περίπτωση μπορούν να χρησιμοποιηθούν μικροσυστοιχίες μικρότερης ή μεγαλύτερης ευκρίνειας. H τεχνική του γενομικού συγκριτικού υβριδισμού (array CGH) απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό ενός εργαστηρίου Μοριακής Γενετικής, καθώς και απομονωμένους χώρους σε ένα περιβάλλον χαμηλών επιπέδων υγρασίας, όζοντος, απουσία φωτός και σκόνης. Ο τελικός καθορισμός των σημαντικών ευρημάτων στηρίζεται σε βάσεις δεδομένων: Decipher (http//www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/), Ecaruca (http//www.ECARUCA.net), UCSC (http://genome.ucsc.edu/), Enseml (http://www.ensembl.org), και Database of Genomic Variants (http://projects.tcag.ca/variation/). Γίνεται σύγκριση των ευρημάτων με υπάρχουσες βιβλιογραφικές αναφορές για καταγεγραμμένα γενετικά σύνδρομα. Από τις βάσεις δεδομένων συγκεντρώνονται και πληροφορίες για το μέγεθος και τη θέση εντοπισμού της κάθε χρωμοσωμικής περιοχής, τα γονιδία που περιέχει αλλά και την ύπαρξη πολυμορφικών περιοχών, γνωστές ως CNPs (Copy Number Polymorphisms). εται στο πρωτόκολλο array CGH της εταιρείας Agilent. Ασθενείς Από το 2000 έως σήμερα ελέγχθηκαν με μοριακό καρυότυπο >200 ασθενείς με διαφορετικού βαθμού ΝΥ, αυτισμό, σπασμούς, δυσμορφικά χαρακτηριστικά και μεμονωμένες ή πολλαπλές συγγενείς ανωμαλίες (ΠΣΑ) και φυσιολογικό καρυότυπο, πολλοί από τους οποίους είχαν ήδη υποβληθεί επίσης σε μια σειρά και από άλλα γενετικά τεστ (εύθραυστο χρωμόσωμα Χ (FRAX), σύνδρομο RETT, απλοί έλεγχοι με FISH ή μεταβολικοί έλεγχοι). Σε αρκετές περιπτώσεις έγινε έλεγχος και των γονεϊκών δειγμάτων DNA με μικροσυστοιχίες ίδιας διακριτικής ευκρίνειας για τον προσδιορισμό του τρόπου κληρονόμησης (de novo ή κληρονομούμενα από τους γονείς). Από τα γονεϊκά δείγματα σε σύγκριση με αυτά των παιδιών, προκύπτουν και τα μη κλινικής σημασίας- πολυμορφικά CNVs. Επιπλέον ο προσδιορισμός του τρόπου κληρονόμησης των χρωμοσωμικών ανακατατάξεων επιτρέπει να δοθεί η σωστή γενετική συμβουλευτική στην οικογένεια στην περίπτωση επόμενης εγκυμοσύνης. Λεπτομερή κλινικά ιστορικά συμπληρώνονται για όλους τους ασθενείς που ελέγχονται κατόπιν εξέτασης από κλινικούς γενετιστές και/ ή παιδονευρολόγους. Στα κλινικά ιστορικά συμπληρώνονται στοιχεία των ασθενών όπως ο βαθμός της νοητικής τους εξέλιξης, η αποτύπωση της κινητικής κατάστασης καθώς και εάν υπάρχουν συγκεκριμένα δυσμορφικά σημεία. Έχει δημιουργηθεί ήδη στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής βάση δεδομένων (εσωτερικός διαδικτυακός τόπος) όπου αποθηκεύονται τα κλινικά στοιχεία των ασθενών καθώς και τα αποτελέσματα του ελέγχου από τον μοριακό καρυότυπο. Η συνεχής ανάπτυξη νέων τεχνολογιών τα τελευταία 5 χρόνια μας έχει δώσει πληρέστερη κατανόηση της δομής του γονιδιώματος και του ρόλου των CNVs στην ποικιλομορφία του γονιδιώματος. Η ανάπτυξη καλύτερου λογισμικού για την ανάλυση των αποτελεσμάτων μας φέρνει στο κατώφλι νέων ανακαλύψεων στις μελέτες συσχέτισης των CNVs και γενικά στην συνεισφορά των δομικών αλλαγών στην αλληλουχία του γονιδιώματος. Η εισαγωγή της νέας τεχνολογίας των array CGH στην κλινική πράξη θα οδηγήσει στην ταχύτερη κλινική διάγνωση ασθενών με ΝΥ και ΠΣΑ και στην διαλεύκανση μηχανισμών που παίζουν ρόλο στην προδιάθεση κοινών νοσημάτων όπως καρδιαγγειακά, τη σχιζοφρένεια και του αυτισμού.
